肺炎鏈球菌是一種有莢膜的革蘭氏陽性菌，其是一種重要的人類病原體，可引起肺炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥，每年全球約有100 萬人因此死亡。其主要毒力因子之一是莢膜多糖 (CPS)，該多糖參與介導(dǎo)細(xì)菌與環(huán)境之間的直接相互作用，保護(hù)病原體免受宿主免疫反應(yīng)機(jī)制的影響。根據(jù)其莢膜多糖，肺炎鏈球菌被分為 90 多種不同的特定類型。

由于每種血清型之間的交叉反應(yīng)有限，許多不同血清型的傳播對有效疫苗的開發(fā)構(gòu)成了挑戰(zhàn)，最佳疫苗應(yīng)包括最普遍和最具毒力的血清型。多糖肺炎球菌疫苗可以在沒有 T 輔助細(xì)胞的情況下刺激 B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體。這種類型的反應(yīng)被稱為胸腺非依賴性反應(yīng)或簡稱為 T 非依賴性反應(yīng)。大多數(shù)多糖不能與主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 一起加工和呈遞，因此不能被輔助 T 細(xì)胞識(shí)別。一般來說，多糖抗原由重復(fù)單元組成，可誘導(dǎo) B 細(xì)胞受體 (BCR) 交聯(lián)，從而激活 B 細(xì)胞。由于缺乏 T 輔助細(xì)胞的協(xié)作，抗體通常親和力較低，主要由 IgM 組成，同種型轉(zhuǎn)換為 IgG 和 IgA 的次數(shù)有限，記憶性 B 細(xì)胞的產(chǎn)生也減少。因此，T 非依賴性抗原是較差的免疫原，尤其是在幼兒中。

由于需要針對這些莢膜多糖的更有效疫苗，因此人們將其與免疫原性載體蛋白結(jié)合，從而產(chǎn)生能夠誘發(fā)更好的T 細(xì)胞依賴性記憶反應(yīng)的結(jié)合物。這些疫苗可被抗原呈遞細(xì)胞 (APC) 處理，蛋白質(zhì)成分中的肽可與 MHC 結(jié)合呈遞，并被輔助 T 細(xì)胞識(shí)別。T 輔助細(xì)胞的激活可誘導(dǎo)更好的反應(yīng)，包括抗體親和力成熟、同種型轉(zhuǎn)換以及誘導(dǎo) B 記憶細(xì)胞產(chǎn)生更好的二次反應(yīng)。

1980 年，Schneerson 及其同事利用多核糖基核糖醇磷酸多糖 (PRP) 與 CRM-197（一種無毒的白喉毒素重組變體）結(jié)合，研制出了一種 b 型流感嗜血桿菌 (Hib) 結(jié)合疫苗。幾年后，由于這種疫苗的成功，惠氏制藥將7種最常見的肺炎鏈球菌的 CPS 與 CRM197 結(jié)合，生成了第一種針對肺炎球菌的結(jié)合疫苗（Prevnar7?）。除了 CPS 和載體蛋白之外，許多其它因素也會(huì)通過結(jié)合方法而影響疫苗的有效性，其中包括特定結(jié)合物的化學(xué)特性、是否存在多糖-蛋白交聯(lián)或間隔臂、以及結(jié)合多糖半抗原的大小等。

純化的多糖可以以天然形式使用，也可以通過機(jī)械或化學(xué)方法降低尺寸。多糖尺寸降低會(huì)降低溶液的粘度，從而促進(jìn)與蛋白質(zhì)載體的化學(xué)結(jié)合。此外，作為 CPS 純化的替代方案，可以使用化學(xué)合成或大腸桿菌糖工程。

本文將簡要介紹再肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗中使用的主要結(jié)合技術(shù)。盡管多糖中OH 基團(tuán)含量高，但它們的反應(yīng)性不足以直接與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此，它們需要活化才能與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。多糖的最佳活化取決于其結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^化學(xué)或酶促反應(yīng)將新的功能基團(tuán)引入這些多糖的結(jié)構(gòu)中，從而賦予它們新的物理化學(xué)和生物學(xué)特性，以用于進(jìn)一步與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。已經(jīng)利用各種用于活化多糖的結(jié)合化學(xué)方法將多糖抗原與蛋白質(zhì)載體結(jié)合。其中包括傳統(tǒng)的、廣泛使用的還原胺化和用溴化氰或相關(guān)基團(tuán)（如 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽 (CDAP)）活化，主要促進(jìn)形成高分子量、異質(zhì)且相對不明確的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。

還原胺塊

很多已獲批的肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗使用該方法，其通過糖源性的醛和蛋白質(zhì)中的胺之間形成席夫堿實(shí)現(xiàn)糖-蛋白質(zhì)結(jié)合，然后進(jìn)行還原。第一步是通過用高碘酸鈉進(jìn)行部分氧化，沿多糖鏈引入醛基。糖環(huán)上的順式二醇和唾液酸殘基是通過高碘酸鹽氧化生成醛的最敏感區(qū)域。然后將載體蛋白添加到反應(yīng)中。糖中的醛通常與載體蛋白的賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)。該方法首先通過席夫堿在糖中的羰基和蛋白質(zhì)中的氨基之間形成鍵，然后用弱還原劑氰基硼氫化鈉將席夫堿還原為更穩(wěn)定的胺。

此外，使用接頭插入化學(xué)手柄進(jìn)行結(jié)合，以減少空間問題，可以改善結(jié)合過程。另一種改善策略是使用銨鹽來提供可用于結(jié)合的反應(yīng)性胺或使用二酰肼間隔物。插入的胺可以直接與蛋白質(zhì)酸殘基的羧基反應(yīng)，或與各種雙功能接頭結(jié)合。

還原胺化由于其簡單性而被廣泛應(yīng)用于糖結(jié)合物的合成，但它的缺點(diǎn)包括產(chǎn)率低、結(jié)合效率低以及多糖結(jié)構(gòu)部分降解的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合方法會(huì)影響所誘導(dǎo)抗體的免疫原性和功能性，導(dǎo)致與野生型血清型的交叉反應(yīng)不足。有研究表明，使用還原胺化結(jié)合19F 多糖會(huì)誘導(dǎo)出一種新的表位，這種表位在 19F 多糖的天然形式或使用氰基化作為結(jié)合方法時(shí)不存在。此外，還原胺化之前的高碘酸鹽氧化步驟可能會(huì)打開糖環(huán)結(jié)構(gòu)，這可能導(dǎo)致開環(huán)結(jié)合物，具體取決于血清型。

還原胺化通常在堿性條件下實(shí)現(xiàn)，原因是早期研究的腦膜炎球菌B和C莢膜多糖中的聚唾液酸對酸不穩(wěn)定。為了避免可能的降解，建議在氰基硼氫化鈉存在下，在 pH 9.0 的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行末端氧化的聚唾液酸與破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合。然而，有研究在通過還原胺化結(jié)合幾種肺炎球菌莢膜多糖的過程中觀察到了堿性條件下多糖的顯著降解，而在微酸性介質(zhì)中進(jìn)行氧化多糖與牛血清白蛋白（BSA）的結(jié)合可以改善還原胺化并防止降解。

1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽（CDAP）氰基化

該方法源自經(jīng)典的糖與蛋白質(zhì)結(jié)合策略，即用溴化氰(CNBr) 活化多糖。雖然CNBr是一種低成本試劑，但它毒性很大，使用時(shí)需要特別注意。已知多糖脂肪族羥基的親核性不足以直接與 CNBr 反應(yīng)，并且不可能在中性 pH 下進(jìn)行反應(yīng)。該傳統(tǒng)方法的特點(diǎn)是在強(qiáng)堿性反應(yīng)介質(zhì)中使用 CNBr?；罨a(chǎn)率僅為 0.5-2%，這意味著使用大量 CNBr，且所需的高pH值條件可能會(huì)損害敏感的多糖。該方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是活化多糖包含不同比例的氰酸酯和亞氨基碳酸酯結(jié)構(gòu)。氰酸酯基團(tuán)在高 pH 下水解，而亞氨基碳酸酯在更酸性的 pH 下水解時(shí)形成無活性碳酸酯。

盡管存在這些缺點(diǎn)，該方法仍然是多糖型基質(zhì)活化的最常用方法之一。作為一種替代策略，可以使用合適的“氰基轉(zhuǎn)移”劑來提高 CNBr 的親電性，這不需要反應(yīng)介質(zhì)中存在強(qiáng)無機(jī)堿，從而可以避免依賴堿的副反應(yīng)。這些復(fù)合物比 CNBr 更親電，因此能夠?qū)⒍嗵侵匈|(zhì)子化形式的羥基氰基化，從而在更低的 pH 下生成氰酸酯。經(jīng)典的氰基轉(zhuǎn)移方法之一是基于 CNBr 和低廉且易于獲得的叔胺 TEA (CTEA) 之間形成高反應(yīng)性鹽型復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)率大大提高，但 CTEA 不穩(wěn)定，在高于 ?10 °C 的溫度下會(huì)衰減。同樣，研究發(fā)現(xiàn)1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸鹽（CDAPBF 4或CDAP）是多糖的高效活化劑。

CDAP 已被引入蛋白質(zhì)-多糖結(jié)合疫苗，用作氰基化劑，用于激活可溶性多糖。與 CNBr 相比，CDAP 更易于使用，其優(yōu)勢在于它可以在比 CNBr 更低的 pH 下激活多糖，且副反應(yīng)更少。與 CNBr 不同，CDAP 激活的多糖可以直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而簡化了工藝流程。此外，CDAP 活化的多糖可以用二胺或二酰肼進(jìn)行功能化，以制備氨基或酰肼衍生的多糖?？梢酝ㄟ^ pH 控制和緩沖液優(yōu)化、以及平衡CDAP的穩(wěn)定性、與多糖羥基的反應(yīng)以及活化多糖的穩(wěn)定性等因素來進(jìn)一步優(yōu)化 CDAP 多糖活化，如提高 pH 值并在低溫下進(jìn)行反應(yīng)，可以減少 CDAP 水解，增加可用于反應(yīng)的活性試劑，且該條件對活化速率的影響極小。

總     結(jié)

近幾十年來，肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗已成為預(yù)防肺炎球菌感染的重要工具。該類疫苗使用多種結(jié)合方法，常見的為還原胺化和CDAP 結(jié)合。盡管這些疫苗取得了重大成功，但這些方法也存在重大缺點(diǎn)，包括產(chǎn)量低和成分降解。因此，最近出現(xiàn)了不同的新設(shè)計(jì)，如使用半乳糖氧化酶法進(jìn)行還原胺化、多抗原呈遞系統(tǒng)平臺(tái)、蛋白聚糖結(jié)合技術(shù)等，以解決傳統(tǒng)方法中可能出現(xiàn)的降解和低定義結(jié)合的特點(diǎn)，它們很可能成為新一代肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗的一部分。

多價(jià)結(jié)合疫苗的典型生產(chǎn)流程，其中多糖單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)，偶聯(lián)至載體蛋白并純化，然后組成形成最終的制劑。

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