單克隆抗體 (mAb) 自幾十年前問(wèn)世以來(lái)，已經(jīng)重塑了生物制藥和靶向治療市場(chǎng)，其開(kāi)發(fā)策略的不斷改進(jìn)產(chǎn)生了一個(gè)充滿(mǎn)希望的未來(lái)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，單克隆抗體是具有高特異性的免疫球蛋白，具有高特異性，選擇性地靶向單個(gè)抗原表位，從而允許對(duì)特定疾病進(jìn)行靶向治療，大大減少副作用并提高療效。治療性單克隆抗體的工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)歷了顯著的增長(zhǎng)擴(kuò)張，且隨著越來(lái)越多的產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，很多此前認(rèn)為的問(wèn)題和挑戰(zhàn)已經(jīng)得到解決，所以當(dāng)前的主要目標(biāo)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿绾芜M(jìn)一步強(qiáng)化和優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

生物工藝優(yōu)化由于其復(fù)雜性以及潛在的高成本性質(zhì)，可能是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，由于這些原因，許多生物制藥公司會(huì)避免在這方面花費(fèi)太多時(shí)間或金錢(qián)。盡管理論上有更好的替代方案和優(yōu)化機(jī)會(huì)，但低效的批次工藝仍然主導(dǎo)著市場(chǎng)?？紤]到在生產(chǎn)過(guò)程的每個(gè)階段必須考慮的眾多工藝參數(shù)，這在某種程度上是可以理解的。

生產(chǎn)治療性單克隆抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)，需在保持90%以上活力的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)非常高的細(xì)胞密度。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須構(gòu)建一種穩(wěn)健且高產(chǎn)的單克隆抗體細(xì)胞系。為此，首先使用一個(gè)具有現(xiàn)有選擇系統(tǒng)的工業(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以專(zhuān)為特異性單抗設(shè)計(jì)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在數(shù)周內(nèi)擴(kuò)增。在此過(guò)程中，鑒定并選擇產(chǎn)量最高的無(wú)性系進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。一旦理想的克隆經(jīng)過(guò)數(shù)周的反復(fù)選擇和擴(kuò)增，小體積的細(xì)胞被放置在低溫保存管中，形成一個(gè)主細(xì)胞庫(kù)。單個(gè)管從這個(gè)主細(xì)胞庫(kù)中取出，用于創(chuàng)建工作細(xì)胞庫(kù)。低溫保存的細(xì)胞通常首先接種在小體積搖瓶中進(jìn)行批次培養(yǎng)。一旦在搖瓶中達(dá)到較高的細(xì)胞密度，細(xì)胞傳代到一個(gè)小的種子生物反應(yīng)器中并再次培養(yǎng)到高密度。這一過(guò)程在越來(lái)越大的種子生物反應(yīng)器中迭代重復(fù)，直到最終進(jìn)入最后的生產(chǎn)生物反應(yīng)器，其體積通常為數(shù)百甚至數(shù)千升。當(dāng)最終培養(yǎng)物低于期望的活力閾值后，通過(guò)離心和過(guò)濾去除細(xì)胞和固體碎片，并保存回收的料液用于下游處理，即mAb純化。

該行業(yè)已經(jīng)實(shí)施了許多改進(jìn)措施，以提高細(xì)胞密度和活力，以及單克隆抗體滴度和質(zhì)量。例如，過(guò)渡到無(wú)血清培養(yǎng)基，以通過(guò)消除培養(yǎng)基組成的可變性，從而提高培養(yǎng)的可重復(fù)性，以及開(kāi)發(fā)細(xì)胞過(guò)程的預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)建模，以節(jié)省優(yōu)化培養(yǎng)條件所需的大量時(shí)間和資源。本文將簡(jiǎn)要介紹在上游工藝中，可能實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化的一些路徑。

一次性生物反應(yīng)器以及提高工藝監(jiān)測(cè)和控制

生物反應(yīng)器的使用為產(chǎn)單抗哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)提供了諸多優(yōu)勢(shì)，但是各種生物反應(yīng)器的尺寸、結(jié)構(gòu)和功能非常不同。在最近的發(fā)展中，許多生物反應(yīng)器制造公司正在將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向一次性生物反應(yīng)器，而不是可重復(fù)使用的不銹鋼生物反應(yīng)器。在大規(guī)模工業(yè)環(huán)境中，一次性生物反應(yīng)器很有吸引力，因?yàn)樗鼈兇蟠蠼档土宋廴镜娘L(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于不銹鋼生物反應(yīng)器，必須在兩次培養(yǎng)之間進(jìn)行大量的清潔和消毒工作，以避免污染。一次性生物反應(yīng)器到貨時(shí)已預(yù)滅菌，并可在使用后進(jìn)行拋棄處理，減少了清潔和消毒所需的時(shí)間和資源，并消除了下一次培養(yǎng)中污染的風(fēng)險(xiǎn)。在生物反應(yīng)器的管路和端口中使用一次性無(wú)菌連接器也是在接種、取樣和培養(yǎng)補(bǔ)液期間保持無(wú)菌性的必要內(nèi)容。當(dāng)然，另一方面，限于一次性生物反應(yīng)器的體積限制，對(duì)于超大型生產(chǎn)規(guī)模，不銹鋼生物反應(yīng)器仍是唯一的選擇。

外圍技術(shù)用于實(shí)時(shí)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)和控制重要的過(guò)程參數(shù)，如pH值、氣體級(jí)聯(lián)強(qiáng)度、溶解的O2、溫度和攪拌速度，隨著用戶(hù)友好和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)軟件的開(kāi)發(fā)，保持穩(wěn)健且自動(dòng)化的過(guò)程控制變得越來(lái)越容易。生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)以及過(guò)程控制和監(jiān)測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)將允許單克隆抗體產(chǎn)品的強(qiáng)化及可重復(fù)性生產(chǎn)。

多寧DuoBioX? Pro一次性生物反應(yīng)器采用底部攪拌式罐體設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)從50 L-2,000 L規(guī)模生物工藝的連續(xù)放大，結(jié)合多寧完全自主研發(fā)制造的3D一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋，具有良好的生物相容性?xún)?yōu)點(diǎn)，其靈活的管路設(shè)計(jì)，滿(mǎn)足各類(lèi)復(fù)雜的上游工藝過(guò)程；其獨(dú)特的攪拌通氣一體組合設(shè)計(jì)，不僅能降低剪切，同時(shí)又保證了優(yōu)異的傳質(zhì)和混勻性能，放大前后工藝一致性好，可廣泛應(yīng)用于生物制藥工藝研發(fā)到GMP生產(chǎn)等各個(gè)階段。

培養(yǎng)模式：補(bǔ)液分批、灌流 vs. 批次培養(yǎng)

在工業(yè)環(huán)境中，批次培養(yǎng)由于其簡(jiǎn)單性和悠久的成功歷史，無(wú)疑是最廣泛用于單克隆抗體生產(chǎn)的方法。然而，補(bǔ)液分批培養(yǎng)原則上可通過(guò)提供關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以防止耗竭來(lái)改進(jìn)培養(yǎng)，但這增加了培養(yǎng)體積。連續(xù)培養(yǎng)采用類(lèi)似的策略，但去除等量的添加體積，以避免增加工作體積和稀釋培養(yǎng)，然而，這導(dǎo)致在補(bǔ)液時(shí)總活細(xì)胞數(shù)減少。灌流培養(yǎng)技術(shù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，過(guò)濾掉營(yíng)養(yǎng)耗竭的培養(yǎng)基和部分細(xì)胞碎片，同時(shí)截留所有細(xì)胞。

這些技術(shù)的實(shí)施在理論上是非常明智的，但實(shí)際納入工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程需要大量的開(kāi)發(fā)以及優(yōu)化時(shí)間和成本。然而，補(bǔ)液分批和灌流技術(shù)的長(zhǎng)期可持續(xù)性和前景已經(jīng)促使一些能夠承擔(dān)高額前期成本和技術(shù)轉(zhuǎn)移的大型生物技術(shù)公司將其更多的工藝從傳統(tǒng)方法中轉(zhuǎn)移出來(lái)。

組學(xué)表征

細(xì)胞系的全面表征是優(yōu)化培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)，更好地適應(yīng)它們的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力需求，對(duì)其組成和行為特征進(jìn)行更深入的了解是必要的第一步。代謝組學(xué)廣泛地描述了細(xì)胞中作為底物、中間體或代謝過(guò)程產(chǎn)物的小分子的大規(guī)模定量，這些小分子共同構(gòu)成了代謝組學(xué)。液相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS) 是代謝組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的方法，其它技術(shù)包括核磁共振 (NMR) 和氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 等。

蛋白質(zhì)組學(xué)類(lèi)似地描述了由細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定和定量。由于蛋白質(zhì)的表達(dá)有多種目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來(lái)表征功能和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組。凝膠電泳和SDS-PAGE是常用的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析方法，質(zhì)譜法與色譜法串聯(lián)使用用于蛋白質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)表征。

基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)需要通過(guò)PCR、DNA微陣列、下一代測(cè)序和RNA測(cè)序等手段繪制和表征細(xì)胞的DNA和轉(zhuǎn)錄RNA，這有助于進(jìn)一步了解特定細(xì)胞系在關(guān)鍵生長(zhǎng)和代謝階段的基因組和功能轉(zhuǎn)錄組。脂質(zhì)組學(xué)描述了通過(guò)質(zhì)譜或核磁共振對(duì)特定脂質(zhì)的色譜分離和隨后的鑒定和定量。像蛋白質(zhì)一樣，脂質(zhì)不僅對(duì)結(jié)構(gòu)組成(即磷脂膜)有重要貢獻(xiàn)，而且對(duì)細(xì)胞代謝也有重要貢獻(xiàn)。所有這些“組學(xué)”技術(shù)，可用于在成功和失敗培養(yǎng)的不同階段開(kāi)發(fā)細(xì)胞特征的綜合信息。

培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和補(bǔ)液策略?xún)?yōu)化

培養(yǎng)基的作用是為培養(yǎng)細(xì)胞提供關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和大分子的唯一外源支持，因此其組成對(duì)mAb生產(chǎn)的優(yōu)化和成功至關(guān)重要。維生素、氨基酸、緩沖鹽、脂質(zhì)和微量金屬的相對(duì)濃度會(huì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生產(chǎn)力和活力產(chǎn)生重大影響，許多細(xì)胞系對(duì)任何成分的偏差都非常敏感。研究發(fā)現(xiàn)，用不含血清的化學(xué)限定培養(yǎng)基替代含血清的培養(yǎng)基，通過(guò)消除血清批次間成分差異的重要來(lái)源，極大地提高了培養(yǎng)的可重復(fù)性，這對(duì)于維持穩(wěn)健的生物工藝尤為重要。然而，考慮到?jīng)]有兩個(gè)細(xì)胞系具有相同的營(yíng)養(yǎng)需求，優(yōu)化單克隆抗體生產(chǎn)的一個(gè)重要步驟是確定培養(yǎng)基組成，以滿(mǎn)足任何給定工業(yè)相關(guān)細(xì)胞系的特定生長(zhǎng)和生產(chǎn)力要求。

這種優(yōu)化可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分和細(xì)胞代謝物的動(dòng)態(tài)消耗和生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察以及前文描述的“組學(xué)”數(shù)據(jù)相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)不同條件下培養(yǎng)代謝行為的顯著變化的識(shí)別，可以闡明關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)?；蛉狈Γ@兩種情況都可能導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制、生產(chǎn)力低下以及有毒代謝物 (如乳酸和氨) 的累積。研究表明，僅通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基就能精確滿(mǎn)足細(xì)胞維持和增殖、單克隆抗體產(chǎn)生和能量代謝的營(yíng)養(yǎng)需求，從而顯著提高單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的單位體積生產(chǎn)力。

多寧細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品研發(fā)團(tuán)隊(duì)根據(jù)mAb的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，重點(diǎn)研究培養(yǎng)基配方機(jī)理、CHO細(xì)胞代謝機(jī)制及培養(yǎng)基穩(wěn)定性，并通過(guò)CHO細(xì)胞代謝模型分析合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了Media C系列和DN feed系列培養(yǎng)基產(chǎn)品。該套產(chǎn)品可滿(mǎn)足不同類(lèi)型CHO細(xì)胞（CHOK1、CHOS、DG44等）的生長(zhǎng)、代謝和表達(dá)需求。Media C系列和DN feed系列結(jié)合了高性能和高品質(zhì)的兩大優(yōu)點(diǎn)，其卓越性已在多個(gè)臨床后期和商業(yè)化項(xiàng)目證實(shí)。

多寧MediaC系列無(wú)血清培養(yǎng)基即DN feed系列補(bǔ)液培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

細(xì)胞內(nèi)的生化過(guò)程已經(jīng)被廣泛繪制，以更好地了解它們的需求和行為，研究人員也能夠應(yīng)用數(shù)學(xué)方程來(lái)描述它們的動(dòng)態(tài)關(guān)系。這是生物工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化中最重要和發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。簡(jiǎn)而言之，DOE是一種優(yōu)化策略，它使用應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)來(lái)生成一系列不同的實(shí)驗(yàn)條件，從而以高度可控的方式對(duì)多個(gè)工藝參數(shù)進(jìn)行綜合測(cè)試。系統(tǒng)地評(píng)估每個(gè)參數(shù)及其對(duì)工藝反應(yīng)的影響，如單克隆抗體產(chǎn)量或細(xì)胞密度，以最大限度地提高生產(chǎn)力，并使可變性最小化。一種稱(chēng)為析因設(shè)計(jì)的技術(shù)用于確定在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行期間要改變哪些因素以及將測(cè)試多少個(gè)水平，例如低、中、高。每個(gè)實(shí)驗(yàn)或運(yùn)行，涉及到一個(gè)獨(dú)特的組合因素水平的應(yīng)用，稱(chēng)為處理。例如在一項(xiàng)3^3因子設(shè)計(jì)中，三個(gè)因素分別在三個(gè)不同的水平上進(jìn)行測(cè)試，雖然該設(shè)計(jì)有27種可能的治療方法，但研究只進(jìn)行了10次試驗(yàn)，這是一個(gè)分?jǐn)?shù)因子設(shè)計(jì)的例子，其中從全因子設(shè)計(jì)中選擇處理的子集，以強(qiáng)調(diào)最可能具有最大影響的變量的重要性，同時(shí)最小化時(shí)間和成本。篩選實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)確定重要因素，以重點(diǎn)進(jìn)行分?jǐn)?shù)因子設(shè)計(jì)。

多寧生物DuoBioX? Explore是一款設(shè)計(jì)領(lǐng)先、性能優(yōu)異、功能齊全并且易于操作的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器系統(tǒng)，適用于生物制藥行業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)研究。用戶(hù)只需要一臺(tái)電腦就能同時(shí)控制1至8臺(tái)玻璃罐相互獨(dú)立或平行組合運(yùn)行，這將極大加速工藝開(kāi)發(fā)進(jìn)程。DuoBioX? Explore多聯(lián)平行反應(yīng)器內(nèi)嵌DoE功能，提供多種DoE方法選擇，功能涵蓋篩選和優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)一鍵分配至衛(wèi)星罐，可實(shí)現(xiàn)無(wú)縫對(duì)接，結(jié)果分析可視化圖形輸出，確定最優(yōu)范圍，是上游工藝條件優(yōu)化和表征研究的最佳搭檔。

DuoBioX? Explore 多聯(lián)平行生物反應(yīng)器系統(tǒng)

*詳細(xì)產(chǎn)品信息，請(qǐng)聯(lián)系marketing@duoningbio.com

A.S.Ali, R.Raju, R.Kshirsagar, et al., Multi-Omics Study on the Impact of Cysteine Feed Level on Cell Viability and mAb Production in a CHO Bioprocess. Biotechnology Journal, 2019.

F.Li,N.Vijayasankaran,A.Shen, et al., Cell culture processes for monoclonal antibody production. mAbs, 2010.

S.F.Abu-Absi, L.Yang, P.Thompson, et al, Defining process design space for monoclonal antibody cell culture. Biotechnology and Bioengineering, 2010.