干細胞在細胞治療、組織工程和再生醫(yī)學以及制藥和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有巨大前景。它們具有自我更新的能力，并能夠根據(jù)分離來源分化成特定的細胞類型。然而，干細胞在臨床應(yīng)用中的使用需要高質(zhì)量和大量的細胞，這需要大規(guī)模擴增干細胞。傳統(tǒng)的細胞維持和擴增方法依賴于使用平面塑料培養(yǎng)板和異種培養(yǎng)基的2D培養(yǎng)技術(shù)，這些方法的擴增有限，細胞在長期傳代后往往會失去克隆和分化能力。干細胞的3D擴增新方法強調(diào)3D細胞生長以模擬體內(nèi)環(huán)境。本文將簡要介紹干細胞3D擴增系統(tǒng)中微載體、生物反應(yīng)器以及培養(yǎng)基等的上游工藝的最新進展以及策略選擇。
微載體的選擇
由于通常從天然來源獲得的干細胞數(shù)量較少，GMP級干細胞培養(yǎng)面臨的主要挑戰(zhàn)之一是選擇最佳擴增系統(tǒng)。該系統(tǒng)必須使用無異種培養(yǎng)基、生長因子和添加物擴增未分化狀態(tài)的干細胞。3D生物反應(yīng)器是克服靜態(tài)培養(yǎng)限制的可行選擇，因為它們提供了一個可放大的系統(tǒng)，其中可以監(jiān)控和控制操作因素。
關(guān)于培養(yǎng)系統(tǒng)的首要選擇要素是生物反應(yīng)器的類型，必須考慮擴增細胞的最終應(yīng)用。例如，攪拌罐生物反應(yīng)器是相對簡單的培養(yǎng)系統(tǒng)，由一個帶有攪拌槳的容器組成，攪拌槳攪拌內(nèi)部物質(zhì)以提供均勻的培養(yǎng)液。此類培養(yǎng)系統(tǒng)已成功測試了在無異種條件下擴增不同類型的干細胞，包括間充質(zhì)干細胞 (MSC)、誘導性多能干細胞 (iPSC) 和胚胎干細胞（ESC）。使用這些系統(tǒng)時需要關(guān)注產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，可能會損壞對剪切敏感的細胞，通過控制攪拌槳的形狀和攪拌速度，可以最大限度地減少這一問題。
該類生物反應(yīng)器系統(tǒng)中必須監(jiān)測和控制的另一個重要參數(shù)是氧飽和度。在不同 O2濃度下培養(yǎng)的干細胞可能在細胞增殖、活力和分化能力方面表現(xiàn)出顯著差異。一些研究測試了在低氧飽和度（約 5%）下培養(yǎng)iPSC和 ESC，在缺氧條件下觀察到細胞從有氧到無氧途徑的顯著代謝變化。但這種情況導致乳酸濃度升高，培養(yǎng)基的 pH 值從中性變?yōu)樗嵝?。當?ESC培養(yǎng)中使用 30% 的氧飽和度時，實現(xiàn)了更高的代謝和細胞生長率。
生物反應(yīng)器的設(shè)計對于臨床級干細胞的擴增至關(guān)重要，并且必須完全符合GMP法規(guī)，而生物反應(yīng)器容器特性（例如材料、尺寸和形狀）是影響細胞生產(chǎn)并最終影響生物工藝成本的關(guān)鍵參數(shù)。生物反應(yīng)器的材料和設(shè)計應(yīng)便于清潔和生產(chǎn)步驟，從而防止任何污染的可能性。在這方面，一些生物反應(yīng)器系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)出使用一次性裝置作為避免清潔過程和降低污染風險的新策略。
上述系統(tǒng)可以與微載體結(jié)合，從而將系統(tǒng)的特性與其融合在一起，所以，未來的趨勢可能集中在探索這些具有不同微載體特性的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以針對特定的干細胞類型，最大限度地提高細胞產(chǎn)量，同時保持其活力和多能性。
維持和擴增干細胞所需的培養(yǎng)基、生長因子、細胞因子和其它添加物是上游生物工藝中的關(guān)鍵元素。培養(yǎng)基配方中包含異種或未定義的化合物以及對細胞功能所涉及的多種分子和細胞機制的不理解是需要解決的主要問題。培養(yǎng)基和添加物中的異種成分具有潛在危險，因為它們可能含有可傳播給培養(yǎng)細胞的致病因子，從而阻礙其用于醫(yī)療應(yīng)用。例如，胎牛血清 (FBS) 是一種低分子量和高分子量生物分子的異種復合混合物，傳統(tǒng)上被包含在培養(yǎng)基配方中以促進細胞生長。然而，眾所周知，它們的生產(chǎn)批次間含量存在顯著差異，從而改變了生物分子的批次間濃度和工藝的可重復性。這在GMP級干細胞培養(yǎng)中必須完全避免，因為它可能含有不良因素，如：內(nèi)毒素、支原體、病毒污染物和朊病毒蛋白。
干細胞培養(yǎng)配方中經(jīng)常添加促進未分化狀態(tài)細胞增殖的細胞因子和生長因子。這些添加物通常來自異種來源，因此它們在臨床干細胞培養(yǎng)中的使用也受到阻礙。但目前已經(jīng)有很多無異種材料的開發(fā)和干細胞培養(yǎng)的應(yīng)用，而有關(guān)使用無異種培養(yǎng)基的報道已證實了細胞的擴增能力及其在整個培養(yǎng)過程中保持分化潛能的能力。
細胞分離
細胞與微載體分離是直接影響細胞活力的重要步驟。目前，已經(jīng)開發(fā)了不同的分離策略，這些策略與基于微載體的生物工藝完全兼容。其中，基于蛋白水解酶的方法最為常用。傳統(tǒng)上，胰腺衍生的牛和豬胰蛋白酶是廣泛用于細胞分離的酶。盡管這些酶很有效，但它們的動物來源使其無法用于醫(yī)療環(huán)境，必須探索無異種替代品。重組胰蛋白酶樣酶，如 TrypLE 和 TrypZean是解決胰蛋白酶使用不便的辦法。雖然這些酶在不同的生物體中表達，但它們在不同的比較研究中表現(xiàn)出與胰蛋白酶相似的干細胞分離活性。
另一個需要考慮的因素是酶孵育時間對細胞表達標志物的影響。如研究顯示，胰蛋白酶在 30 分鐘時會降低多種細胞表面表達標志物，而 TrypLE 不會影響任何一種。另有研究顯示，MSC過度暴露于 TrypLE 酶（60 分鐘）可顯著降低多能性表達標志物。酶孵育時間是成功實現(xiàn)細胞分離而不影響細胞完整性和活力的重要參數(shù)。雖然較長的酶孵育時間與細胞損傷和細胞死亡有關(guān)，但由于蛋白質(zhì)鍵的不完全斷裂，短時間會阻礙細胞分離。因此，必須嚴格規(guī)范細胞與酶的接觸時間，以防止細胞活力及其特性的下降。為了克服這種時間上的挑戰(zhàn)，研究將胰蛋白酶孵育與攪拌相結(jié)合，這減少了酶孵育時間并減少了細胞對酶活性的過度暴露。其它的替代方案是使用刺激響應(yīng)性材料來克服酶促分離的缺點。這些材料可以與外部刺激發(fā)生反應(yīng)，例如溫度、pH 值或電解質(zhì)濃度的變化，從而導致其尺寸/大小、結(jié)構(gòu)、溶解度或分子間相互作用發(fā)生改變。從這個意義上說，目前的趨勢是尋找簡化分離過程并減少或最終消除酶使用的新材料。用于藥物遞送系統(tǒng)、納米顆粒和組織工程應(yīng)用的新型材料可以推廣到微載體的制造。
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C.McKee, G.R.Chaudhry, Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2017.
A.Ebrahimian, M.Schalk, et al., Seed Train Optimization in Microcarrier-Based Cell Culture Post In Situ Cell Detachment through Scale-Down Hybrid Modeling. Bioengineering, 2024.
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