在過(guò)去的十幾年里，許多生物制藥公司已經(jīng)轉(zhuǎn)向使用基于聚合物的一次性生物工藝材料來(lái)開(kāi)發(fā)生物產(chǎn)品，包括生物反應(yīng)器袋、容器、管路、接頭以及其他生產(chǎn)設(shè)備。特別是一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)，由于其靈活性等多方面的優(yōu)勢(shì)，在生物制藥生產(chǎn)中的應(yīng)用穩(wěn)步增加。盡管這些系統(tǒng)提高了生產(chǎn)效率，但它們的使用也存在挑戰(zhàn)和監(jiān)管問(wèn)題，這其中就包括可提取物/可析出物的風(fēng)險(xiǎn)，這會(huì)影響生物制品的總體產(chǎn)量和純度。

可提取物是在比塑料和系統(tǒng)簡(jiǎn)單接觸更惡劣的條件下，從塑料中提取出來(lái)的物質(zhì)。而可析出物是因塑料和系統(tǒng)之間相對(duì)溫和的相互作用而進(jìn)入產(chǎn)物液流中的物質(zhì)。這些物質(zhì)可能以工藝污染物、雜質(zhì)或反應(yīng)副產(chǎn)物的形式存在?？商崛∥?可析出物和產(chǎn)物成分之間的相互作用已被證明可能改變生物制品的物理化學(xué)性質(zhì)，從而對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，在生物工藝材料研究中識(shí)別和量化這些可提取物/可析出物是很重要的，以確保最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量，并維持患者的安全。

重金屬是最重要的可提取和可析出物之一，可導(dǎo)致目標(biāo)生物制品的物理化學(xué)變化。有毒金屬可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、活力和產(chǎn)物的產(chǎn)出。仔細(xì)監(jiān)測(cè)和控制金屬物質(zhì)水平在生物工藝過(guò)程中至關(guān)重要。本文將簡(jiǎn)要介紹在生物工藝中可能存在的重金屬可提取和可析出物及其影響。

鈷

鈷是一種可提取/可析出的金屬，潛在地存在于生物工藝過(guò)程中所使用的一次性袋子中，被認(rèn)為是一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)因素。鈷在生物工藝過(guò)程中可能導(dǎo)致多種危險(xiǎn)因素，特別是它對(duì)CHO細(xì)胞中半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響及其對(duì)IgG表達(dá)的影響，且因其濃度變化而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響有所不同，從而導(dǎo)致對(duì)生物制品的不同影響。如有研究測(cè)量了細(xì)胞生長(zhǎng)必需的輔助因子錳和濃度在0– 1 mM之間的鈷的影響，證實(shí)鈷對(duì)半乳糖轉(zhuǎn)移酶的影響是劑量依賴性的，隨著鈷濃度的增加，酶活性降低，這是由于酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被錳和鈷占據(jù)，且與錳相比，鈷的結(jié)合導(dǎo)致了較低的活化。

同時(shí)，研究還評(píng)估了鈷對(duì)重組CHO 細(xì)胞中 IgG 表達(dá)的影響，以了解其對(duì)糖基化的影響。采用不同的鈷濃度，結(jié)果顯示，3 天后，300 μM 的濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，從 200 μM 濃度開(kāi)始，IgG 滴度降低了 50%。在 50 μM 或更低的濃度下，未觀察到對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。盡管濃度在 1-100 μM 之間的鈷會(huì)增加 CHO 細(xì)胞中的半乳糖基化水平，但添加錳可以稍微逆轉(zhuǎn)并改善這種半乳糖基化效果。 鈷還會(huì)導(dǎo)致 ROS 生成增加，其本身會(huì)通過(guò)降低溶氧水平刺激缺氧介導(dǎo)的反應(yīng)。此外，50 μM 的鈷導(dǎo)致 G1F 聚糖增加 3%，而 200 μM 的非半乳糖基化 (G0F) 增加 5%。還注意到，在 200 μM 鈷存在時(shí)，乳酸產(chǎn)量有所增加。 

鎳

鎳也被認(rèn)為是一種微量金屬，會(huì)在生物工藝過(guò)程中對(duì)CHO 細(xì)胞產(chǎn)生毒性。糖基化是一種重要的翻譯后修飾，會(huì)影響 CHO 細(xì)胞中的糖蛋白。它有助于提高生物制品的質(zhì)量，并需要在整個(gè)生物工藝過(guò)程中進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析。鎳會(huì)從生物工藝中使用的不同設(shè)備中析出，析出程度受溶液 pH 值、濃度、鹽含量和溫度的影響。

研究分析了鎳對(duì) CHO 細(xì)胞的影響，顯示鎳會(huì)抑制果糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，鎳影響ROS的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并減少半乳糖基化。繼而使重組 IgG 糖基化顯著減少。研究還測(cè)試了鎳對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的影響。在高達(dá) 50 μM 的鎳存在下，生長(zhǎng)或活力沒(méi)有變化。高于 200 μM 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著降低，而活力保持 > 60%，直到鎳濃度達(dá)到 1 mM。當(dāng)鎳濃度達(dá)到 200 μM 時(shí)，乳酸產(chǎn)量增加。當(dāng)鎳濃度 > 1 mM 時(shí)，還觀察到 IgG 糖基化從 32% 減少到 25%。

研究還評(píng)估了鎳對(duì)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。如前所述，錳是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的重要輔助因子，因此，添加不同濃度的錳和鎳以確定這是否會(huì)逆轉(zhuǎn)糖基化降低。盡管添加錳增加了糖基化，但不足以完全抑制降低。

鎳被評(píng)估為生物工藝過(guò)程中的主要析出物之一，需確定其對(duì)蛋白質(zhì)聚集和沉淀的影響。來(lái)自不同設(shè)備的極少量鎳會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。這種沉淀可以通過(guò)鎳和蛋白質(zhì)單體之間可能的螯合來(lái)解釋。此外，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有評(píng)估的賦形劑中都發(fā)現(xiàn)了痕量的鎳。

銅

雖然銅被認(rèn)為是多種代謝途徑中的基本元素，但由于產(chǎn)生ROS，高濃度銅可能具有毒性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此，生物工藝設(shè)備的銅析出可以破壞最佳平衡、誘導(dǎo)毒性、并阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。有研究分析了在不產(chǎn)生毒性的情況下，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中銅的最大含量。使用不同水平的銅對(duì)CHO細(xì)胞處理超過(guò)14天。獲得正常細(xì)胞生長(zhǎng)而沒(méi)有任何毒性的銅的最小閾值在每壓實(shí)細(xì)胞體積30-60 nM之間。用高水平的銅處理CHO細(xì)胞會(huì)通過(guò)增加IgG產(chǎn)物的修飾而對(duì)生物制品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。研究還表明，CHO細(xì)胞需要最低水平的銅才能存活并實(shí)現(xiàn)最佳性能。已知C端脯氨酸酰胺化是由肽基甘氨酸羥化單加氧酶催化的，該酶需要與銅結(jié)合才能被激活。較高的銅濃度增加了該反應(yīng)，導(dǎo)致更多的IgG產(chǎn)生。但銅水平超過(guò) 50 μM 會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集增加，從而進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)質(zhì)量下降。

有實(shí)驗(yàn)證明，與銅水平較低的處理組相比，對(duì)照組的細(xì)胞活力更高，推測(cè)這是由于銅含量高而在細(xì)胞內(nèi)積累較慢。同時(shí)，他們還得出結(jié)論，0-100 μM 范圍內(nèi)的銅水平不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。另有研究顯示，銅會(huì)在 CHO 細(xì)胞中引起生物蓄積行為，從而中斷細(xì)胞生長(zhǎng)。這種蓄積現(xiàn)象可以通過(guò)銅對(duì)谷胱甘肽-氧化還原平衡的影響得到進(jìn)一步解釋，眾所周知，谷胱甘肽是抵抗毒性的重要保護(hù)劑。這種不平衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)中斷。有人建議，壓實(shí)細(xì)胞體積中的銅濃度應(yīng)大于 30 nM 才能獲得所需的益處，同時(shí)保持低于 60 nM，以避免銅毒性。

總 結(jié)

生物制藥生產(chǎn)已經(jīng)開(kāi)始廣泛使用一次性生物工藝系統(tǒng)，這種向一次性塑料系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變需要對(duì)可提取物和析出物進(jìn)行監(jiān)管和監(jiān)測(cè)，以確?；颊甙踩?。盡管最終藥品中可提取物和析出物的濃度較低，但它們能夠影響產(chǎn)品質(zhì)量，并存在隨后增加進(jìn)入患者體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)最常見(jiàn)的可提取物和析出物的安全閾值進(jìn)行評(píng)估，可以確保生物生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)胞活力。例如，鈷、鎳和銅分別> 200 μM、>200 μM 和 >60 nM。鈷和鎳都會(huì)導(dǎo)致缺氧介導(dǎo)的反應(yīng)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。保持這些有毒金屬的安全濃度對(duì)于避免對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、活力和產(chǎn)物生產(chǎn)產(chǎn)生任何負(fù)面影響至關(guān)重要。同樣，為了確保高質(zhì)量產(chǎn)品的生產(chǎn)和患者安全，有效監(jiān)測(cè)這些有害可提取物和析出物的濃度至關(guān)重要。

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DuoWave?波浪式一次性生物反應(yīng)器及細(xì)胞培養(yǎng)袋

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