細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的產(chǎn)物質(zhì)量判斷主要根據(jù)其提供目標(biāo)生物活性的能力，同時(shí)最大限度地減少造成任何生物危害的風(fēng)險(xiǎn)。在大多數(shù)情況下，以生物學(xué)分析甚至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的形式直接檢測(cè)生物活性并不容易，相反，會(huì)檢查一些易于測(cè)量的物理特征和化學(xué)結(jié)構(gòu)特征來(lái)評(píng)估產(chǎn)物質(zhì)量。

產(chǎn)物的質(zhì)量不是一成不變的，有可能隨著時(shí)間而改變。這種質(zhì)量的可變性可能在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的不同階段通過(guò)產(chǎn)物合成而變化。它也可能發(fā)生在產(chǎn)物收獲過(guò)程中，甚至在蛋白質(zhì)被純化并儲(chǔ)存在制劑溶液中之后。根據(jù)化學(xué)或物理變化的性質(zhì)，產(chǎn)物質(zhì)量變化可能以快速或緩慢的動(dòng)力學(xué)方式發(fā)生。因此，質(zhì)量不僅應(yīng)在藥物底物和制劑后的產(chǎn)品上進(jìn)行衡量。對(duì)于在緩慢動(dòng)力學(xué)中變化的變量，質(zhì)量也在儲(chǔ)存條件下進(jìn)行評(píng)估。例如，經(jīng)過(guò)純化和制劑的蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，可能會(huì)出現(xiàn)顏色，或者溶液可能因聚集而變得混濁。這種質(zhì)量變化只能隨著時(shí)間的推移進(jìn)行評(píng)估。

一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)品必須不含某些已知的污染物，或能夠?qū)⑵淇刂圃谝欢ㄋ揭韵?。例如，以嚙齒動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療產(chǎn)品即使經(jīng)過(guò)純化也可能攜帶一些宿主細(xì)胞成分。在產(chǎn)物純化過(guò)程中未被去除的宿主蛋白質(zhì)、DNA污染物和最終產(chǎn)品中存在的內(nèi)源性病毒必須保持在可接受的水平以下，以盡量減少這些污染物對(duì)患者造成的風(fēng)險(xiǎn)。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體經(jīng)常出現(xiàn)在由細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中，比如蛋白質(zhì)分子序列中的氨基酸與編碼序列對(duì)應(yīng)的氨基酸不同。即使沒(méi)有已知的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的不利影響，異構(gòu)體也必須保持在被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)的某一水平以下。

蛋白質(zhì)的聚糖結(jié)構(gòu)也總是表現(xiàn)出異質(zhì)性。在聚糖結(jié)構(gòu)影響蛋白質(zhì)生物活性的情況下，具有所需或不需要結(jié)構(gòu)的聚糖的含量必須保持在一定范圍內(nèi)。即使在聚糖結(jié)構(gòu)不直接影響蛋白質(zhì)生物活性的情況下，也必須指定聚糖的異質(zhì)性程度，并且在不同時(shí)間或不同生產(chǎn)地點(diǎn)生產(chǎn)的不同批次的產(chǎn)品都必須符合相同的規(guī)格。

結(jié)構(gòu)特征和生物活性

細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通常都很復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、病毒和細(xì)胞本身。評(píng)估它們的質(zhì)量并不容易。用作疫苗的病毒的質(zhì)量取決于其引發(fā)免疫原性反應(yīng)的能力。對(duì)于基因治療，產(chǎn)物病毒的質(zhì)量取決于其感染靶細(xì)胞和表達(dá)載荷基因的能力。不同的治療性蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物學(xué)作用的機(jī)制非常不同。有些結(jié)合并中和或去除目標(biāo)分子，而另一些則與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合并引發(fā)殺傷細(xì)胞的殺傷力。在工藝過(guò)程中直接評(píng)估此類生物學(xué)功能通常是不可行的。相反，需要利用作用模式的機(jī)制知識(shí)，根據(jù)對(duì)生物功能至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)特征來(lái)開發(fā)產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)。例如，對(duì)于流感病毒，除了病毒顆粒計(jì)數(shù)外，血凝素水平也可以作為質(zhì)量指標(biāo)。在基因治療中，轉(zhuǎn)基因拷貝與病毒顆粒的比率可用作質(zhì)量衡量標(biāo)準(zhǔn)。在涉及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）活性的治療性 IgG 生產(chǎn)中，巖藻糖基化聚糖被用作質(zhì)量衡量標(biāo)準(zhǔn)。因此，了解所涉及產(chǎn)物的作用模式對(duì)于使用結(jié)構(gòu)屬性作為質(zhì)量指標(biāo)非常重要。

糖基化特性

附著在糖蛋白上的聚糖在結(jié)構(gòu)上是異質(zhì)的。這可以在血液循環(huán)中的糖蛋白以及細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)中看到。一些蛋白質(zhì)的聚糖結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)的治療功效中起著至關(guān)重要的作用。例如，許多溶酶體酶的聚糖上存在的 6-磷酸甘露糖對(duì)于介導(dǎo)蛋白質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)膜上的 6-磷酸甘露糖受體結(jié)合以進(jìn)行攝取至關(guān)重要，這是將酶靶向溶酶體所必需的步驟。因此，這些酶的聚糖上 6-磷酸甘露糖的豐度水平對(duì)于治療溶酶體貯積病至關(guān)重要。在某些情況下，聚糖結(jié)構(gòu)不會(huì)直接影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，但會(huì)影響其藥代動(dòng)力學(xué)行為，例如，促紅細(xì)胞生成素和其它一些蛋白質(zhì)上更高含量的唾液酸會(huì)增加這些蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期，如果沒(méi)有唾液酸，暴露的半乳糖會(huì)與肝細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)化和降解。

一個(gè)蛋白質(zhì)在其序列中可能有多個(gè)糖基化位點(diǎn)。給定位點(diǎn)上的聚糖結(jié)構(gòu)是不均勻的。相反，它由許多不同的結(jié)構(gòu)組成。這種異質(zhì)性是其在高爾基體中的生物合成反應(yīng)的結(jié)果。在不同的生產(chǎn)過(guò)程中，或在不同的生產(chǎn)條件或細(xì)胞系下，聚糖的特性也可能有所不同。這種可變性對(duì)其臨床療效的影響取決于蛋白質(zhì)的作用方式。對(duì)一些蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，這是非常重要的，而對(duì)其它一些蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，它可能會(huì)影響血液循環(huán)半衰期，但不會(huì)影響生物活性。然而，從監(jiān)管的角度來(lái)看，產(chǎn)品的聚糖分布特性必須在規(guī)定的范圍內(nèi)。因此，將聚糖分布限制在可接受的范圍內(nèi)對(duì)于產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要。更好地理解產(chǎn)品的作用方式可以幫助定義產(chǎn)品可接受的異質(zhì)性范圍。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體

在選擇給定產(chǎn)品的生產(chǎn)細(xì)胞系之前，應(yīng)驗(yàn)證整合到基因組中的產(chǎn)品基因的所有拷貝的DNA序列，以確保轉(zhuǎn)基因的完整性。因此，預(yù)期蛋白質(zhì)的一級(jí)序列和二級(jí)、三級(jí)、甚至四級(jí)結(jié)構(gòu)將是一致的。然而，天然蛋白質(zhì)和重組蛋白質(zhì)中確實(shí)存在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。這是由于翻譯錯(cuò)誤、不完整的翻譯后酶加工、分泌后細(xì)胞外酶促或化學(xué)反應(yīng)等導(dǎo)致的。在更高的結(jié)構(gòu)水平上，蛋白質(zhì)分子可能形成二聚體或寡聚體，并且可能打亂二硫鍵，甚至形成大的聚集體和沉淀。在一級(jí)序列水平上，序列異構(gòu)體包括蛋白質(zhì)中不正確的氨基酸摻入和氨基酸的化學(xué)修飾。

許多生產(chǎn)細(xì)胞系具有產(chǎn)品基因的多個(gè)拷貝。利用高通量DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)候選生產(chǎn)細(xì)胞系基因組中多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的DNA序列進(jìn)行驗(yàn)證，以確保其完整性。一旦選擇了細(xì)胞系，轉(zhuǎn)基因的拷貝隨后發(fā)生突變的可能性非常低。然而，在罕見的情況下，這些拷貝中的一個(gè)發(fā)生錯(cuò)義突變，即導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸改變的突變，將不可避免地導(dǎo)致一小部分突變蛋白質(zhì)分子的存在。

一些常見的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括氨基酸錯(cuò)配、電荷異構(gòu)體以及更高階結(jié)構(gòu)的變化。許多蛋白質(zhì)的C端有賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基在細(xì)胞內(nèi)被羧肽酶裂解。然而，裂解通常是不完整的。C端未裂解賴氨酸經(jīng)常出現(xiàn)在循環(huán)中的天然蛋白質(zhì)以及重組蛋白的生產(chǎn)中。工業(yè)補(bǔ)料分批培養(yǎng)通常采用高葡萄糖濃度。因此，分泌的產(chǎn)物蛋白質(zhì)分子長(zhǎng)期暴露在高葡萄糖濃度下。糖基化是指糖與氨基酸側(cè)鏈上的氨基的結(jié)合，這種現(xiàn)象很常見。糖基化也見于人體循環(huán)中的蛋白質(zhì)中。

一些氨基酸修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)凈電荷的變化。這些電荷異構(gòu)體可能是酸性物質(zhì)，在陰離子交換層析柱中比“正常”產(chǎn)物蛋白質(zhì)洗脫得更快，或者是堿性物質(zhì)，在陽(yáng)離子交換柱中洗脫得更快。帶酸性電荷的異構(gòu)體也可能由糖基化模式的變化引起，例如唾液酸或硫酸鹽含量的增加。

工藝控制和產(chǎn)物質(zhì)量

蛋白質(zhì)中聚糖特性的異質(zhì)性主要是細(xì)胞內(nèi)生物合成事件的結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞活性較低時(shí)，蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液后，細(xì)胞釋放的酶會(huì)降解聚糖，尤其是唾液酸被唾液酸酶去除。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化大多發(fā)生在蛋白質(zhì)翻譯之后，源于細(xì)胞內(nèi)的事件或者是在蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基后的培養(yǎng)液中。蛋白質(zhì)加工酶可由細(xì)胞通過(guò)分泌或由于細(xì)胞裂解而釋放。細(xì)胞外蛋白水解裂解已被證明會(huì)導(dǎo)致因子VIII的降解。一些更高階的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，如聚集、蛋氨酸的氧化以及天冬酰胺的脫酰胺，甚至可能發(fā)生在產(chǎn)物回收過(guò)程中。

對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的日益重視要求我們更好地了解細(xì)胞內(nèi)事件如何影響糖基化特性，以及細(xì)胞外培養(yǎng)環(huán)境如何影響蛋白質(zhì)異構(gòu)體的發(fā)生。理想情況下，這應(yīng)該提高我們控制工藝條件的能力，并提供一致的生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量。工藝技術(shù)的發(fā)展越來(lái)越注重用于在線監(jiān)測(cè)和控制的過(guò)程分析技術(shù) (PAT)，而與PAT攜手并進(jìn)的是質(zhì)量源于設(shè)計(jì) (QbD)。

QbD的目的是發(fā)展對(duì)工藝過(guò)程的理解，識(shí)別對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響最大的過(guò)程變量。這將有助于制定控制這些變量的策略，并將產(chǎn)品質(zhì)量屬性限制在可接受的范圍內(nèi)。為了實(shí)現(xiàn)QbD，需要了解定義產(chǎn)品質(zhì)量的屬性，并理解過(guò)程變量和質(zhì)量屬性之間的關(guān)系。最初，可能依賴于過(guò)程變量和質(zhì)量屬性相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。隨著時(shí)間的推移，機(jī)制模型對(duì)于開發(fā)預(yù)測(cè)控制策略變得至關(guān)重要。在這樣的工作中，質(zhì)量和生產(chǎn)力是不可分離的。對(duì)生產(chǎn)力和質(zhì)量方面的培養(yǎng)環(huán)境的機(jī)制理解被納入過(guò)程模型，后者將過(guò)程輸入轉(zhuǎn)化為維持生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量的必要控制行動(dòng)。此外，基于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的整體分析方法的進(jìn)步，與系統(tǒng)方法相結(jié)合，將促進(jìn)PAT和QbD在細(xì)胞培養(yǎng)生物工藝中的實(shí)施。

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