腺相關(guān)病毒（AAV）是基因治療中最常用的載體，其是非致病性細(xì)小病毒，直徑約20 nm，無(wú)囊膜，基因組長(zhǎng)約4.8 kb，其兩端為反向重復(fù)序列（ITR），對(duì)復(fù)制、衣殼化等過(guò)程有重要作用，中間為rep與cap兩個(gè)開(kāi)放閱讀框。AAV本身不編碼DNA聚合酶，僅依賴宿主細(xì)胞或輔助病毒合成自己的基因組，所以無(wú)法自主完成復(fù)制。AAV在人類和其它靈長(zhǎng)類中相當(dāng)普遍，目前已知有11個(gè)血清型，此外，為提高AAV在臨床和研究作為載體的效率，開(kāi)發(fā)了許多AAV的人工變型，其在核酸序列，特別是衣殼蛋白的高可變區(qū)存在差異，從而導(dǎo)致在基因遞送中的不同特性，如全球第1個(gè)獲批的、基于AAV的產(chǎn)品Glybera?利用AAV1遞送脂蛋白脂肪酶（LPL），以治療LPL缺乏患者。2017年獲批的Luxturna?基于AAV2，用于治療萊伯氏先天性黑蒙，后者導(dǎo)致進(jìn)行性失明，而2019年獲批的Zolgensma?基于AAV9，用于治療脊髓型肌萎縮（SMA）。

AAV的上游生產(chǎn)有不同的平臺(tái)策略可選，包括單純皰疹病毒（HSV）感染、昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)以及穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系，但基于HEK293細(xì)胞質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法是目前制備臨床試驗(yàn)物料的主流方法，其具有更高的適應(yīng)性且易于使用，前期工程工作量較低，有助于快速啟動(dòng)首次人體研究[3]?；谒矔r(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)AAV的典型工藝步驟包括：基于貼壁或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒載體生產(chǎn)、細(xì)胞裂解、純化 – 包括澄清、親和捕獲層析、離子交換精純層析、切向流過(guò)濾濃縮/洗濾和最終過(guò)濾以及制劑/灌裝。

與AV上游策略類似，貼壁 vs. 懸浮培養(yǎng)的選擇需根據(jù)平臺(tái)技術(shù)能力、所處的開(kāi)發(fā)階段、目標(biāo)適應(yīng)癥和給藥策略以及預(yù)計(jì)病毒載體需求量等因素綜合考慮，對(duì)于患者群體基數(shù)較大、需系統(tǒng)性給藥或每劑病毒載體含量較高的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)基于懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)策略將更有利于確保所需的規(guī)模縮放能力，已有報(bào)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了高達(dá)2,000 L的AAV懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)[4]。上游工藝開(kāi)發(fā)的目的是探索病毒生產(chǎn)的最佳條件，包括通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)染條件而提高轉(zhuǎn)染效率并確保其在大規(guī)模生產(chǎn)條件下的一致性，以及通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基配方等策略增強(qiáng)病毒生產(chǎn)力、維持病毒感染性。

盡管有些AAV血清型會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程中部分分泌病毒顆粒至細(xì)胞培養(yǎng)液中，但為了提高病毒的收率，AAV的下游工藝以在封閉條件下進(jìn)行的細(xì)胞機(jī)械或化學(xué)裂解以及DNA片段化開(kāi)始，之后的澄清步驟旨在去除殘留的大量質(zhì)粒DNA以及細(xì)胞裂解產(chǎn)生的宿主細(xì)胞污染物。澄清過(guò)濾器的選擇需考慮濁度降低水平、高產(chǎn)物收率以及規(guī)模放大的簡(jiǎn)便性。對(duì)于AAV的親和層析捕獲，目前已有針對(duì)多種血清型的特異性親和填料，通常，單步親和捕獲即可達(dá)到較高的純度，但為確保達(dá)到特定的雜質(zhì)去除水平要求，一般結(jié)合使用離子交換層析作為精純步驟。特別是對(duì)于AAV生產(chǎn)中分離空衣殼和完整衣殼的挑戰(zhàn)，離子交換層析是目前生產(chǎn)規(guī)模中最常用的方法?？找職け槐O(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)為是過(guò)程中雜質(zhì)，需盡可能降低其百分比，并控制空/完整衣殼比例，以確保基因治療產(chǎn)品的一致性。切向流過(guò)濾旨在濃縮產(chǎn)物并置換至合適的緩沖液體系，鑒于AAV較小的粒徑，可選擇MWCO 100kD的膜組件，而除菌過(guò)濾旨在降低微生物負(fù)荷，滿足所需的無(wú)菌性法規(guī)要求。